水凝膠可以為間充質(zhì)干細(xì)胞提供生存環(huán)境，但是它遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足自然細(xì)胞外基質(zhì)的需要。尤其在干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，細(xì)胞的自發(fā)增殖、凝結(jié)、分化以及基質(zhì)沉淀等行為在膠體中仍受到限制。

為使水凝膠基質(zhì)能調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的行為，北京大學(xué)口腔醫(yī)院ShichengWei課題組將仿生多肽和KGN融合到水凝膠體系中，研究不同多肽的作用及KGN的緩釋對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨的影響。本文的題目是AchondrogenesisinductionsystembasedonafunctionalizedhyaluronicacidhydrogelsequentiallypromotinghMSCproliferation,condensation,differentiation,andmatrixdeposition,ActaBiomaterialia期刊。

在MeHA上接枝的肽對(duì)膨脹和彈性應(yīng)變沒有影響。較長(zhǎng)的交聯(lián)時(shí)間可以提高凝膠基體的彈性模量；較小的交聯(lián)度可以增加水凝膠的孔徑，而較大孔隙的水凝膠往往與促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、聚集和基質(zhì)分泌等作用密切相關(guān)。

圖1：功能性水凝膠的制備和性能測(cè)定。

圖2:2維和3維基質(zhì)中有典型的hMSCs圖像。

RGD可促進(jìn)細(xì)胞的伸展和增殖，根據(jù)交聯(lián)程度的不同，其形態(tài)和活性也不同。延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間(90和120s)限制了細(xì)胞的擴(kuò)散、遷移和增殖。RGD能指導(dǎo)這些細(xì)胞的行為，但是高的交聯(lián)可以抑制它們。而RGD促進(jìn)了整合素的高表達(dá)，且交聯(lián)時(shí)間較短。調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性與軟骨缺損植入物所需的高彈性模量之間存在著一定的矛盾。

圖3：封裝在2D和3D基體中的hMSCs的增殖和活性。

軟骨粘附(NCAM1和N-cadherin)及遷移(FAK)相關(guān)蛋白和基因數(shù)據(jù)表明，純MeHA凝膠基質(zhì)在HAV肽的作用下不能聚集MSCs，說(shuō)明需要合適的水凝膠基質(zhì)微環(huán)境來(lái)發(fā)揮HAV對(duì)MSCs的作用。HR組FAK、NCAM1、N-cadherin表達(dá)明顯高于其它組，表現(xiàn)為軟骨分化。提示兩種肽在細(xì)胞粘附和遷移中具有協(xié)同作用，但其機(jī)制尚不清楚。

圖4：培養(yǎng)3天后的間質(zhì)凝聚分析。

圖5：包被KGN的肽修飾水凝膠(HR)，包被KGN的PLGA的微球(PM)，以及包被KGN的PLGA的微球修飾水凝膠(PM-HR)。在凝膠體系中，PM-HR組的釋放速率最小，KGN達(dá)到緩釋；

結(jié)果表明：K@PM-HR組細(xì)胞數(shù)量、ACAN、Coll-Coll-HR組的細(xì)胞數(shù)較多；有關(guān)的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)含量表明，該水凝膠系統(tǒng)可持續(xù)促進(jìn)HMSCs的增殖、聚集和形成成軟骨細(xì)胞。

圖6：在HMSC中培養(yǎng)14天(A-I)和28天(J-R)，觀察軟骨形成情況。

HR,K@HR和K@PM-HR組分泌更多的不透明基質(zhì)，K@HR組和K@PM-HR組的標(biāo)本更密、更亮，與軟骨類似。提示KGN對(duì)軟骨分化的調(diào)節(jié)和軟骨基質(zhì)分泌的促進(jìn)作用。HR組，K@HR組和K@PM-HR組細(xì)胞分布較廣，多為基質(zhì)分泌。

圖7：在皮下植入28、56天后，裸鼠體內(nèi)含有hmsc的水凝膠植入體被移除。

K@HR組和K@PM-HR組的體重顯高于空白對(duì)照組和HR組，HR,K@HR和K@PM-HR組的細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組。說(shuō)明保持KGN的恒定和有效濃度，可以促進(jìn)hMSCs的軟骨分化，這是K@PM-HR組GAG和Coll的最高分泌量。

圖8：裸鼠皮下注射水凝膠后軟骨形成的實(shí)驗(yàn)研究。

在HAV肽調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用的同時(shí)，RGD肽可增強(qiáng)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖。與RGD相比，HAV與RGD共同作用后，細(xì)胞聚集和軟骨形成更加明顯。通過(guò)3d打印凝膠支架、微流體技術(shù)和軟骨組織工程等手段，該功能化持續(xù)釋放的KGNHA凝膠可促進(jìn)HMSCs分化，并有希望成為干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和臨床應(yīng)用的支架載體。

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