定制合成 Custom synthesis
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多肽固相合成法是多肽合成有機化學的一個重大的提升。它的最大的優(yōu)點是不必純化中間物質,合成過程能夠連續(xù)開展,從而為多肽合成的自動化奠定了基本。目前全自動多肽的合成,基本上全是固相合成。其主要過程以下:
根據Fmoc化學合成,先將所需合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不可溶的高分子樹脂相接,然后以這一氨基酸的氨基做為多肽合成的起始點,同其他的氨基酸早已活化的羧基功效產生肽鍵,持續(xù)重復這一過程,就可以獲得多肽。依據多肽的氨基酸構成不一樣,多肽后處理方法不一樣,純化方法也是有差別。
1.做免疫用的多肽多長為合適?
一般約10-15個氨基酸,自然長一些免疫效果非常的好一些,但是合成費用也會提升。MAP多肽則期待長短在15aa之上,實際效果不錯。此外,10aa下列的多肽免疫實際效果非常差。
2.免疫用多肽的純度必須很高嗎?
一般而言,免疫用Peptide,70-85%就可以。
3.大家合成的多肽溶解性不太好,多肽就有問題對不對?
難以準確預測一個多肽的溶解性及合適的溶劑是什么。假如多肽無法溶解就覺得多肽合成有問題這一觀念并有誤。
4.多肽情況是怎樣?如何保存存儲?
大家?guī)淼亩嚯氖欠蹱?,一般為灰白,構成不一樣,多肽粉末狀的色調有差別,多肽一般長期性儲存必須遮光儲存,并應儲存在-20度,短期內能夠儲存在4度。能夠短期內得話是以室內溫度運送。
5.怎樣溶解多肽
溶解多肽是比較復雜的事兒,一般難以一下子明確合適的有機溶劑。一般是先取一點實驗,在都沒有明確合適的有機溶劑前千萬別合部溶解。以下方式有利于您挑選合適的有機溶劑:
(1)判斷多肽的正電荷特殊,設置酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1;堿性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其他氨基酸的正電荷為0。測算出將電荷數。
(2)假如凈電荷數>0,多肽為堿性,自來水溶解:如果不溶解或溶解性并不大,加入醋酸(10%之上);假如多肽還不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀釋。
(3)假如凈電荷數<0,多肽為酸性,自來水溶解;如果不溶解或溶解性并不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀釋。
(4)假如凈電荷數=0,多肽為中性,一般必須用有機溶劑如乙腈,甲醇或異丙醇,DMSO等溶解。也有人建議必須尿素來溶解疏水性非常大的多肽。
6.非HPLC純化的多肽中有什么雜質?
粗品和除鹽等級的多肽中多肽和非多肽類雜質:如非總長多肽和多肽后處理的一些原材料如DTT、TFA等。
7.HPLC純化的多肽有什么雜質?
歷經HPLC純化的多肽,仍會出現一些一些雜質存有,在其中的雜質主要是短肽和少量TFA。
8.多長的多肽為合適?
多肽合成必須考慮到多肽的長短,正電荷,親疏有別水溶性等要素。長短越長,合成粗品的純度和產出率都隨之減少,純化的困難和沒法合成的概率便會大些。自然多肽功能分區(qū)的編碼序列是難以更改的,可是為了更好地多肽的順利合成,有時候必須在作用取的上中下游提升一些輔助氨基酸,以改進多肽的溶解性和親疏有別水溶性。假如多肽過短,合成也很有可能有問題,關鍵情況是合成的多肽后面處理方式中有一定的難度系數,5肽下列的多肽,一般要有親水性的氨基酸,不然后處理難度系數增加。15個氨基酸殘基下列的多肽一般都能夠取得認可的產出率和得率。
9.怎樣從多肽編碼序列中判斷多肽的溶解性?
(1)多肽中假如帶有高比率的疏水性較強的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp,多肽難以溶解與水溶性水溶液中或壓根不太可能溶解。這種氨基酸不論是純化或合成,都是有很有可能有問題。
(2)一般狀況下疏水性氨基酸的占比<50%,不可以連續(xù)5個連續(xù)aa為疏水性,帶正電荷的氨基酸的(正電K,R,H,N-terminus,負電D,E,C-terminus)的占比做到20%,在多肽的N或C短假如能提升旋光性氨基酸,還可以改進溶解性。11.為何帶有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?
帶有Cys,Met,或Trp的多肽無法合成,與此同時難以獲得高純的商品。關鍵是因為這種官能團不穩(wěn)定,易空氣氧化。這種多肽的應用和存儲都必須需注意,防止不斷打開外蓋。
10.為何有一些多肽的合成產出率或純度會非常低?
多肽合成與引子合成有非常大的差別,不可以合成的引子非常少,可是不可以合成的多肽經常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這種氨基酸鄰或重復時,多肽鏈在合成過程中無法完全舒展溶解,合成效率降低。下列多種情況,合成效率和物質的純度都非常低,如:重復Pro,Ser-Ser,重復Asp,4個連續(xù)Gly等。
11.多肽是怎樣純化的?
多肽純化一般應用正相反柱(如C8,C18等),214nm。緩存管理體系一般為含TFA的有機溶劑,pH2.0。BufferA為含0.1%TFAinddH2O,BufferB為1%TFA/ACN/pH2.0。純化前用BufferA溶解;假如溶解不太好,用BufferB溶解后,然后用BufferA稀釋;對疏水性強的多肽,有時候還必須加入少量的FormicAcid或醋酸。HPLC剖析多肽粗物質,假如多肽不長(15aa下列),一般會出現主峰,主峰一般為總長物質;針對20aa之上的長肽,要是沒有主峰,HPLC需配搭Mass來判斷相對分子質量,從而明確哪個峰是所需合成的多肽。
寫到最后:
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