無論是商品化蛋白或是公司內(nèi)部自身開發(fā)設(shè)計(jì)的蛋白 ，在提純得到蛋白到應(yīng)用以前通常必須保存第幾周至好多個(gè)月不一 。 

在此期間維持蛋白理化性質(zhì)的穩(wěn)定性尤為重要 ，文中簡略介紹了造成蛋白質(zhì)集聚，沉積 ，轉(zhuǎn)性等情況的要素 ，并詳細(xì)介紹了一些 保存對(duì)策來提高蛋白質(zhì)的可靠性 。 

如今就帶大伙兒打開濃濃的干貨知識(shí)之行 。

蛋白質(zhì) 理化性質(zhì)改變的要素

蛋白質(zhì)可靠性發(fā)生問題的第一個(gè)特點(diǎn)通常是發(fā)生沉積 ，沉淀中通常帶有非純天然的蛋白質(zhì)集聚物，且這類集聚一般是不可逆的，通常不能夠修復(fù)自然的蛋白質(zhì)的功能 ，除非是將集聚物融解于轉(zhuǎn)性液，如尿素溶液或鹽酸胍中，再根據(jù)復(fù)性除去轉(zhuǎn)性液使蛋白質(zhì)分子再次折疊 ，修復(fù)純天然構(gòu)像 。

（1）強(qiáng)烈 刺激性 下的蛋白質(zhì) 沉積 及應(yīng)對(duì)措施

多種多樣強(qiáng)烈的傷害可以造成蛋白沉淀 ，包含pH 值轉(zhuǎn)變 ，環(huán)境溫度轉(zhuǎn)變，融凍 ，在拌和（蛋白質(zhì)暴露于氣體 -水頁面 ），過慮 （蛋白質(zhì)暴露于液體 -固態(tài)頁面 ）等，以上要素均可以造成蛋白空間布局的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而產(chǎn)生沉積 。

當(dāng)溶液中非純天然蛋白質(zhì)集聚物充足小時(shí) ，如二聚體，四聚體等，蛋白質(zhì)可以維持可溶解情況 。 

掌握這種集聚物的成分水準(zhǔn)十分關(guān)鍵 ，由于 與純天然 蛋白 對(duì)比 ，其構(gòu)造和活力很有可能早已 發(fā)生了轉(zhuǎn)變 ，即使這種集聚物保持 在2%-3%那樣很低的水準(zhǔn) ，也可以拼裝形核 ，進(jìn)而推動(dòng)蛋白質(zhì)迅速的集聚和沉積。 

這就可以表述為何某類 蛋白在比較穩(wěn)定的保存 一段時(shí)間后，忽然 產(chǎn)生很多沉積，可溶集聚 物在做到開啟能量源轉(zhuǎn)化成的閥值水準(zhǔn)以前沉積不容易 產(chǎn)生 ，將帶有可溶集聚物的蛋白質(zhì)暴露于強(qiáng)烈的條件中，如拌和或過慮 ，可以更快的推動(dòng)能量源的生成和沉積 。

（2）氨基酸主鏈發(fā)生變化造成蛋白質(zhì)沉積及應(yīng)對(duì)措施

除開 強(qiáng)烈刺激性 ，氨基酸主鏈發(fā)生變化也是蛋白沉淀的主要要素 ，如有氧化和水解反應(yīng)到時(shí)候導(dǎo)致蛋白作用 改變 。

酶促反應(yīng)結(jié)構(gòu)域 處的甲硫氨酸殘基的氧化會(huì)造成蛋白質(zhì)失活，在甲硫氨酸和胱胺酸 殘基及其帶有芳香族主鏈的氨基酸 （谷氨酸 ，組氨酸和酪氨酸 ）最易于產(chǎn)生化學(xué)作用 ，分子結(jié)構(gòu)氧的存有 ，賦形劑及其 器皿中還原性污染物質(zhì)都能夠引物設(shè)計(jì)化學(xué)作用 ，比如帶有氧化還原反應(yīng)活力的金屬離子，瓶蓋中帶有殘余的原子團(tuán)殘?jiān)?/span>等均可造成化學(xué)作用 ，一般添加一些增稠劑 ，如綿白糖 ，對(duì)純天然情況夯實(shí) ，可以減緩暴露殘廢的氧化率。

水解作用既可以出現(xiàn)在氨基酸的主鏈 （像天冬酰胺和谷氨酰胺殘基 產(chǎn)生的脫氟苯 功效）還可以產(chǎn)生在肽碳鏈 上，造成肽官能團(tuán)的激光切割 ，天冬酰胺殘基的脫氟苯功效高寬比在于相鄰的殘基 ，若下一個(gè)氨基酸是甘氨酸 ，其溶解的速率更快 。 

多肽鏈部分的軟性可以危害脫氟苯 功效 ，大部分主要的外界因素 如pH 值，緩沖溶液類型可以加快這些反映 ，在堿性 pH 和濃度較高的的緩沖溶液中，反應(yīng)速率尤其快。

蛋白質(zhì)普遍的多種保存方法

（1）在液體狀態(tài)下不凍結(jié)保存

蛋白質(zhì)一般在2-8℃開展 短期內(nèi)保存 ，這對(duì)保持蛋白的可靠性尤其合理 ，殊不知蛋白質(zhì)即使不產(chǎn)生集聚沉積 ，也會(huì)產(chǎn)生遲緩的化學(xué)降解過程 ，蛋白質(zhì)在溶液情況下的集聚水平最少 ，大部分蛋白質(zhì)平穩(wěn)的pH范疇較小，在這里范疇以外，蛋白質(zhì)去折疊的工作能力加強(qiáng)。 

非特異性增稠劑 ，如綿白糖 ，在其濃度做到 0.5 M時(shí)，對(duì)保持 蛋白質(zhì)的可靠性具備不錯(cuò)的實(shí)際效果 。 很多添加物，如硫酸銨，甘氨酸 ，聚乙二醇 ，綿白糖 等，可以根據(jù)優(yōu)先選擇 排阻 （PreferentialExclusion）的方式保持 蛋白質(zhì) 的熱學(xué) 可靠性 ，在其中檸檬酸鈉鹽緩沖溶液實(shí)際效果最好 。

此外 一種保持蛋白質(zhì)可靠性不錯(cuò)的辦法 是減少蛋白質(zhì)的濃度 ，較低濃度的可以減少蛋白質(zhì)的集聚率，這類速率對(duì)蛋白質(zhì)的濃度十分比較敏感 ， 殊不知 ，蛋白質(zhì)的濃度也不能過低，如小于0.1 mg /ml ，過較低濃度的的蛋白會(huì)導(dǎo)致非特異性的吸咐到器皿的內(nèi)壁 ，進(jìn)而導(dǎo)致損害 。

除此之外 ，蛋白質(zhì)緩沖溶液的含鹽量針對(duì)保持蛋白質(zhì) 溶液的可靠性十分關(guān)鍵 ，如PBS緩沖溶液中，NaCl的濃度通常保持在150 mM ，這是由于溶液中正離子的電荷屏蔽掉減少了蛋白質(zhì)分子間的電荷 -電荷 排斥功效 ，這種離子濃度的選擇必須實(shí)際的實(shí)驗(yàn)提升 

（2）在凍結(jié)環(huán)境溫度下保存

冷藏保存是蛋白質(zhì)存儲(chǔ)的基本方式 。 

在低溫情況下，蛋白質(zhì)溶解的速度減少 ，在超低溫不造成蛋白質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)性時(shí)，試品可以平穩(wěn)保存好多個(gè) 月，在-80 ℃甚至于 更低的環(huán)境溫度 下，蛋白 的保存時(shí)間更久。

殊不知，冷藏也會(huì)造成很多蛋白的轉(zhuǎn)性，這種要素包含超低溫 ，物質(zhì)的量濃度的濃度 ，冰-液體頁面的產(chǎn)生 ，pH 值的強(qiáng)烈 波動(dòng) 等。 

凍存蛋白最易犯的不正確是應(yīng)用磷酸鹽緩沖液 ，超低溫下的堿性鹽結(jié)晶體 ，而酸堿性鹽依然可溶解 ，那樣倍他米松 的pH值降低許多 ，如pH4，這會(huì)導(dǎo)致 很多蛋白產(chǎn)生轉(zhuǎn)性 ，在冷藏期內(nèi) pH 不太發(fā)生變化的緩沖溶液有檸檬酸鈉鹽，Tris，組氨酸等。

在蛋白質(zhì)溶液中添加保護(hù)劑可以合理減少蛋白轉(zhuǎn)性 和沉積 ，這種方式 包含 ：添加凡士林 ，鹽析鹽和二糖，通常濃度高過 0.3 M，可具有不錯(cuò)的功效，添加表活劑 ，其能與蛋白質(zhì)分子競(jìng)爭冰-液體頁面 來抑止 蛋白質(zhì)變性，通常濃度 低至0.1 %，就能 得到有效的實(shí)際效果  ，添加 BSA 或高聚物 也可以抑止冷藏造成的蛋白質(zhì)去折疊 ，一般添加占比為百分之幾十 。 

根據(jù) 提升蛋白質(zhì)的起止濃度 ，可以提高在融凍過程中蛋白質(zhì)制取物對(duì)損害的耐受力 ， 當(dāng)蛋白質(zhì)的起止濃度提高時(shí)，轉(zhuǎn)性蛋白質(zhì)分子的百分?jǐn)?shù)也會(huì)降低 。針對(duì) -80 ℃和-20 ℃保存 ，優(yōu)選 -80 ℃。 

一方面超低溫可以比較大水平減少蛋白溶解速度 ；另一方面因?yàn)?/span> -20 ℃電冰箱常常電源開關(guān)的特性 ，環(huán)境溫度一般 達(dá)不上 -20℃，尤其是靠門的地區(qū) ，特別是無霜冰箱中還會(huì)繼續(xù)發(fā)生不斷融凍的狀況 。 

并且，-20 ℃貼近 一些 鹽的共融點(diǎn)，在這個(gè)環(huán)境溫度左右易導(dǎo)致結(jié)晶的不斷融凍 ，造成蛋白質(zhì)變性。 

最終必須指出的是，蛋白要避免重復(fù)融凍 ，散裝凍存 ，每回融化 一支 ，隨后應(yīng)用 。

（3）凍干 保存

凍干是將溶劑或懸浮物質(zhì)在較低溫度下冷藏 ，隨后將其由固態(tài)立即提升為氣體的一種干燥方式 ，

該方式可以非常好地維持成分骨架的可靠性 ，而且在復(fù)融后都不 改變 。

凍干 一般 包含三個(gè)過程 ：預(yù)凍結(jié)，提升干燥 (或稱第一階段干燥 )，分析干燥 (或稱第二階段干燥 )，雖然凍干可以比較好 的保持蛋白的可靠性 ，可是 在凍干過程中加上必需的增稠劑以防止蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)性至關(guān)重要 ，這在其中并以還原型的海藻糖和綿白糖對(duì)蛋白質(zhì)的維護(hù)最有效。 

凍干過程要避免應(yīng)用還原型糖，如葡萄糖水，麥牙糖，乳清蛋白等，其會(huì)造成美拉德（Maillard）反映溶解蛋白質(zhì) ，在冷藏期內(nèi) ，維護(hù)水平在于起止的總糖 濃度 ；在干燥期內(nèi) ，維護(hù)功效在于糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比。 

冷藏維護(hù)是因?yàn)?/span>從蛋白質(zhì)表面的優(yōu)先選擇排阻 ，那樣便提升了去折疊的活化能 ，在干燥期內(nèi) ，伴隨著與蛋白質(zhì)分子表面 產(chǎn)生水合作用的水被除去 ，蛋白質(zhì)分子去折疊 ，糖可以 利用在凍干蛋白質(zhì)的缺水部位融合氫氧根離子來防止這類毀壞 。

因?yàn)?/span>凍干加工工藝繁雜 ，設(shè)備價(jià)格昂貴，耗能比較大 ，這也是一般實(shí)驗(yàn)室承受不住的，通常做為蛋白保存的最終選擇 。 

針對(duì)凍干初學(xué)者而言 ，設(shè)定下列狀態(tài)變量會(huì)降低探索時(shí)間 ：制取蛋白的原始濃度相對(duì)性高些，可以提升對(duì)冷藏的耐受力 ，并降低要干燥的容積 ；應(yīng)用充足的海藻糖或綿白糖來抑止在冷藏和干燥中的蛋白去折疊。 

假如蛋白質(zhì)制劑可以承受冷藏 ，糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比例在1-2中間 ，通常可以合理的防止在干燥過程中蛋白質(zhì)的去折疊 。 在冷藏 期內(nèi) ，假如必須 維護(hù) ，糖的起止濃度通常必須做到200 -300mM才可以達(dá)到最好維護(hù) ，最終，必須明確的是蛋白質(zhì)保存樣本中，盡量不能帶有蛋白酶，蛋白酶的催化具備精確性 ，催化高效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高過有機(jī)物催化劑 。 

寫到最后：

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